Живой

Nature Communications, том 13, номер статьи: 4337 (2022) Цитировать эту статью

6794 Доступа

18 цитат

24 Альтметрика

Подробности о метриках

Исправление издателя к этой статье было опубликовано 13 октября 2022 г.

Эта статья обновлена

Мы сообщаем о живой аттенуированной вакцине-кандидате SARS-CoV-2 с (i) реконструированными последовательностями вирусного регулятора транскрипции и (ii) удаленными открытыми рамками считывания (ORF) 3, 6, 7 и 8 (∆3678). Вирус ∆3678 реплицируется примерно в 7500 раз ниже, чем дикий тип SARS-CoV-2 на первичных культурах дыхательных путей человека, но восстанавливает свою репликацию на дефицитных по интерферону клетках Vero-E6, которые одобрены для производства вакцин. Вирус ∆3678 сильно ослаблен как на моделях хомяков, так и на моделях мышей K18-hACE2. Иммунизация однократной дозой вируса ∆3678 защищает хомяков от заражения и передачи вируса дикого типа. Среди удаленных ORF в вирусе ∆3678 ORF3a отвечает за наибольшее ослабление за счет антагонизма фосфорилирования STAT1 во время передачи сигналов интерферона типа I. Мы также разработали репортерный вирус mNeonGreen ∆3678 для высокопроизводительной нейтрализации и антивирусного тестирования. В целом результаты показывают, что ∆3678 SARS-CoV-2 может служить кандидатом на живую аттенуированную вакцину и исследовательским инструментом для потенциального использования уровня 2 биобезопасности.

Пандемия COVID-19, вызванная SARS-CoV-2, привела к более чем 513 миллионам подтвержденных случаев заражения и 6,2 миллионам смертей (по состоянию на 1 мая 2022 года; https://coronavirus.jhu.edu/). Для COVID-19 были успешно разработаны различные платформы вакцин, включая мРНК, вирусный вектор, субъединичный белок и инактивированный вирус. Живые аттенуированные вакцины против SARS-CoV-2 активно не исследовались, хотя они могут иметь преимущества в виде низкой стоимости, высокой иммуногенности и потенциально длительного иммунитета1. Вирион SARS-CoV-2 состоит из внутреннего нуклеокапсида, образованного геномной РНК, покрытой белками нуклеокапсида (N), и внешней оболочки, образованной билипидной мембраной клеточного происхождения, окруженной шипом (S), мембраной (M). и белки оболочки (E)2. Геном одноцепочечной вирусной РНК с плюсовой полярностью кодирует открытые рамки считывания (ORF) для шестнадцати неструктурных белков, которые формируют аппарат репликации (ORF1a/ORF1b), четырех структурных белков (S, E, M и N) и семь вспомогательных белков3. Хотя точные функции вспомогательных белков SARS-CoV-2 еще предстоит определить, предыдущие исследования других коронавирусов показывают, что эти белки не важны для репликации вируса, но могут модулировать репликацию и патогенез посредством взаимодействия с путями хозяина4,5,6,7, 8. Таким образом, удаление дополнительных белков можно использовать для ослабления SARS-CoV-2.

Коронавирусы реплицируют и транскрибируют субгеномные РНК (sgRNA) посредством прерывистого механизма транскрипции, который опосредован регуляторными последовательностями транскрипции (TRS). TRS представляют собой консервативные нуклеотидные последовательности, расположенные вблизи 5'-конца генома и на 5'-концах нижестоящих ORF (рис. 1а). Эти TRS регулируют транскрипцию посредством спаривания оснований между лидерным TRS и TRS тела, что приводит к продукции sgRNAs, которые транслируют нижестоящие ORF9,10,11. Внутри TRS основная последовательность из 6–8 нуклеотидов управляет образованием пары оснований между возникающей РНК и лидерным TRS. Ранее было показано, что изменение направляющей последовательности TRS-сети SARS-CoV может привести к созданию ослабленного вируса. Такой TRS-мутантный SARS-CoV может служить подходом к использованию живой аттенуированной вакцины для минимизации риска реверсии12,13.

Схема построения Δ678 и Δ3678 SARS-CoV-2. Делеции были введены в остов штамма USA-WA1/2020. Зеленые и красные прямоугольники обозначают исходную и мутированную последовательности TRS соответственно. T7 Промотор T7, лидерная последовательность L, регуляторные последовательности транскрипции TRS; Открытая рамка считывания ORF, ген гликопротеина оболочки E, ген гликопротеина мембраны M, ген нуклеокапсида N, нетранслируемая область UTR, хвосты pA поли A. б Морфология бляшек рекомбинантных вирусов WT, Δ678 и Δ3678. Анализ бляшек проводили на клетках Vero-E6 и окрашивали на 2,5 день после заражения. c–e Кинетика репликации SARS-CoV-2 WT, Δ678 и Δ3678 на клетках Vero-E6 (c), Calu-3 (d) и HAE (e). Вирусы WT, Δ678 и Δ3678 инокулировали в клетки Vero-E6, Calu-3 и HAE при MOI 0,01, 0,1 и 2 соответственно. После 2-часовой инкубации клетки трижды промывали DPBS и непрерывно культивировали в свежем 2% FBS DMEM. В культуральных супернатантах измеряли титры инфекционного вируса с использованием анализа бляшек на клетках Vero-E6. f Внутриклеточные уровни РНК WT, Δ678 и Δ3678 в клетках HAE на 7-й день после заражения. Клетки НАЕ трижды промывали PDBS, лизировали Тризолом для выделения РНК, количественно определяли вирусные РНК с помощью RT-qPCR. c–f Точки представляют собой отдельные биологические повторы (n = 3 для Vero-E6 и Calu-3; n = 5 для HAE). Значения на графике представляют собой среднее ± стандартное отклонение. Непарный двусторонний t-критерий использовался для определения существенных различий между группами WT и Δ678/Δ3678. Значения P были скорректированы с использованием поправки Бонферрони для учета множественных сравнений. Различия считали значимыми, если р < 0,025. мНГ-положительные клетки HAE после заражения вирусом mNG WT или mNG Δ3678 при MOI 0,5. Показаны репрезентативные изображения мНГ-положительных клеток из трех независимых экспериментов; низкое разрешение мНГ-положительных изображений объяснялось тем, что культура НАЕ состояла из многослойных живых клеток на пластиковой вставке, которую помещали в 6-луночные планшеты. Масштабная линейка, 100 мкм. c–f Исходные данные предоставляются в виде файла исходных данных.